蛋白質(zhì)含量測(cè)定法
蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，是生物化學(xué)研究中常用、基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。
folin—酚試劑法早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng),而且對(duì)后者的影響還要大得多。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用. 索萊寶公司提供的Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒可以用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，簡(jiǎn)單快速。
Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒
貨號(hào)：PC0010
規(guī)格：2500T
保存：開(kāi)封使用后請(qǐng)密封保存，本試劑盒自訂購(gòu)之日起九個(gè)月內(nèi)有效。
產(chǎn)品內(nèi)容：
組成 包裝（2500微孔) 保存
5×G250 染色液 100ml 2-8℃
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA) 1ml -20℃
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
考馬斯亮蘭G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的大吸收峰的位置（Imax），由 465nm變?yōu)?595nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定的吸光度值 A595 與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá) 1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá) 5mM，但受略高濃度的去垢劑影響，需確保 SDS 的濃度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產(chǎn)的 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
操作說(shuō)明：操作說(shuō)明：
一．微孔酶標(biāo)儀法
1. *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10ul，稀釋至 250ul ，使終濃度為 0.2mg/ml。待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 雙蒸水，混勻成 1×G250染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中，加 PBS 稀釋液補(bǔ)足到 20 微升。
4. 將樣品作適當(dāng)稀釋?zhuān)ê枚嘧鰩讉€(gè)梯度，如作2 倍、4 倍、8 倍稀釋?zhuān)?20 微升到96 孔板的樣品孔
中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2 后。
5. 各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250染色液，室溫放置 3-5 分鐘。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定 A595，或560-610nm之間的其它波長(zhǎng)的吸光度。
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。
二．分光光度計(jì)法
如無(wú)酶標(biāo)儀，染色反應(yīng)可在離心管中進(jìn)行，反應(yīng)液混勻后加入比色皿中，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。
步驟如下：
1. 取八支（或者更多）干凈的 10ml 離心管，標(biāo)記上號(hào)。
2. 取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml。
3. 5×G250 染色液使用前請(qǐng)顛倒 3-5 次混勻，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 雙蒸水，混勻成 1×G250 染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
4. 按下表加入試劑(以每孔 5ml 計(jì)，多余的用來(lái)清洗比色皿)
離心管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7（樣品管 1） 8（樣品管 2） 9（樣品管 3）
標(biāo)準(zhǔn)蛋白 BSA 0ul 100ul 200ul 300ul 400ul 500ul 500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 1
500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 2
……
PBS 500ul 400ul 300ul 200ul 100ul 0ul 0ul 0ul 0ul
1XG250 染色液 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
5. 反應(yīng) 3 分鐘后測(cè) OD 值。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可每間隔 2 分鐘加一管染色液，每間隔 2 分鐘測(cè)一管 OD
值。如下表：
離心管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 ……
加染色液（分鐘） 0 2 4 6 8 10 12 14 ……
測(cè) OD值 3 5 7 9 11 13 15 17 ……
考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。