結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 （GBSS）試劑盒 說明 技術(shù)文章

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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 （Granule-Bound Starch Synthase，GBSS）試劑盒

商品貨號(hào)：QS3405
英文名稱：Granule-bound starch synthase Assay Kit
別名：結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒 GBSS Kit 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS）試劑盒
檢測(cè)方法：常量法

產(chǎn)品詳細(xì)介紹

測(cè)定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。

測(cè)定原理：

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過340nm下測(cè)定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。

產(chǎn)品說明書

貨號(hào)：QS3405-50            規(guī)格：50 管/48 樣

   結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase，GBSS）試劑盒說明書 

            紫外分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈 淀粉的合成。

測(cè)定原理：

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP； 進(jìn)一步通過反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還 原為 NADPH，其中 NADPH 生成量與前一步反應(yīng)生成的 ADP 數(shù)量呈正比，通過 340nm 下測(cè)定 NADPH 的增加量，可以計(jì)算 GBSS 活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×2 瓶，4℃保存；

液體一：7mL×2 瓶，4℃保存；

液體二：4mL×2 瓶，4℃保存；

液體三：8mL×2 瓶，4℃保存；

粉劑一：2 支，4℃保存；

粉劑二：2 支，4℃保存；

粉劑三：2 支，-20℃保存；

粉劑四：2 支，4℃保存；

粉劑五：2 支，4℃保存；

粉劑六：2 支，-20℃保存；

粉劑七：2 支，-20℃保存；

粉劑八：2 支，4℃保存；

粉劑九：2 支，4℃保存；

粉劑十：2 支，-20℃保存；

試劑一：液體×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

反應(yīng)液Ⅰ的配制：臨用前取液體一、粉劑一、粉劑二和粉劑三各一支，依次把粉劑一、粉 劑二和粉劑三轉(zhuǎn)移到液體一中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

反應(yīng)液Ⅱ的配制：臨用前取液體二、粉劑四、粉劑五、粉劑六和粉劑七各一支，依次把粉 劑四、粉劑五、粉劑六和粉劑七轉(zhuǎn)移到液體二中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融。

反應(yīng)液Ⅲ的配制：臨用前取液體三、粉劑八、粉劑九和粉劑十各一支，依次把粉劑八、粉 劑九和粉劑十轉(zhuǎn)移到液體三中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

粗酶液制備：

稱取 0.1~0.2g 組織（建議稱取約 0.1g 組織），加入 1mL 提取液，冰浴中勻漿。10000g ， 4℃離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑 

混勻后立即在 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算 Δ A=A2-A1。

注意：反應(yīng)液Ⅰ如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

GBSS 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GBSS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×10⁹ ]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù) =522×Δ A÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min/g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109 ]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T× 稀釋倍數(shù)=522×Δ A÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，5.7×10^-4 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.71；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。