粒體檸檬酸（ MCA）含量試劑盒 說明 技術(shù)文章

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線粒體檸檬酸（Mitochondrion Citric Acid, MCA）含量 試劑盒

商品貨號(hào)：QS2107
英文名稱：Mitochondrial citric acid(MCA) Content Assay Kit
別名：線粒體檸檬酸含量測定試劑盒 MCA Kit 線粒體檸檬酸(MCA）含量測定試劑盒 線粒體檸檬酸(MCA）含量測試盒
檢測方法：常量法

產(chǎn)品詳細(xì)介紹

測定意義：

CA是線粒體三羧酸循環(huán)的個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。

配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和CA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況，（3）乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和CA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。

測定原理：

CA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出CA的含量。

產(chǎn)品說明書

貨號(hào)：QS2107-25                        規(guī)格：25 管/24 樣

   線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書

                 分光光度法

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CA 是線粒體三羧酸循環(huán)的個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰 CoA 與草酰乙酸合成， 其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。 配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量， 其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮 酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β -氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況，（3）乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。

測定原理：

CA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α -酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α -酮酸進(jìn)一 步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α -酮酸苯腙；α -酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長下吸光度 的變化程度可反映出 CA 的含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 石英比色皿、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

堿性提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 7.5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 7.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存；

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，10μ mol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提取：

    稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μ L 該上 清液和 300μ L 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），取此溶液 300μ L 和 300μ L 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量 測定）。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 330nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。

3、樣本測定：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。

充分混勻，330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，Δ A=A2 –A1。

檸檬酸含量計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

檸檬酸含量(μ mol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(Δ A 測定管－Δ A 空白管)÷(Δ A 標(biāo)準(zhǔn)管－Δ A 空白 管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(Δ A 測定管－Δ A 空白管)÷(Δ A 標(biāo)準(zhǔn)管－Δ A 空白管)÷Cpr 蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(Δ A 測定管－Δ A 空白管)÷(Δ A 標(biāo)準(zhǔn)管－Δ A 空白 管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(Δ A 測定管－Δ A 空白管)÷(Δ A 標(biāo)準(zhǔn)管－Δ A 空白 管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μ mol/mL； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.3mL；V 樣總：加 入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

低檢測限為10nmol/mg prot或1μ mol/g鮮重。